Ampicillin 5 days

Für die Vervielfältigung der Klonierungsprodukte werden verschiedene Organismen als Wirt genutzt. Bekannte Beispiele sind Bakterienzellen wie das Bakterium Escherichia coli, einzellige Algen oder Ampicillin 5 days. Schematische Darstellung einer Klonierung mit Restriktion und Ligation.

Nach der anschließenden Transformation werden rekombinante Bakterien durch Plattieren auf Agarplatten mit einem geeigneten Antibiotikum selektioniert. Wenn die Vektoren dies erlauben, werden mittels Blau-Weiß-Screening Kolonien ausgemustert, die kein Insert enthalten. Auch damit ist noch nicht gesichert, dass alle anderen Kolonien das gewünschte Insert enthalten. Bei dieser Variante wird die einzufügende DNA-Sequenz in einer PCR mit Primern vervielfältigt, die jeweils eine mit dem Vektor überlappende Sequenz am 5′-Ende enthalten. Restriktion der einzufügenden DNA und des Plasmids erübrigt. Durch Isothermal Assembly werden durch PCR oder künstliche Gensynthese hergestellte DNA-Fragmente, ohne dass diese zuvor mit Restriktionsenzymen behandelt werden müssen, in einen linearisierten Vektor eingefügt. Voraussetzung ist, dass die zu ligierenden Moleküle Sequenzüberlappungen von etwa 20 Nukleotiden aufweisen.

5’ Exonuklease-Aktivität der T4-DNA-Polymerase werden in Anwesenheit eines dNTPs komplementäre Überhänge im Vektor und im PCR-Produkt erzeugt. Bei einer Gateway-Klonierung werden Sequenzen an das Transgen angefügt, das Erkennungssequenzen für die Ligase attB enthält, die den Einbau des Transgens in einen entry vector katalysiert. Hierbei wird gleichzeitig im entry vector das Selbstmordgen ccdB entfernt, wodurch nur transgene Organismen mit Vektor heranwachsen. Die Golden-Gate-Klonierung, auch als Golden Gate-Assembly bekannt, erlaubt mit Hilfe von Typ-IIs-Restriktionsenzymen und T4-DNA-Ligase den simultanen direktionalen In-vitro-Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente. Die synthetisierten Doppelstränge enthalten schon die geeigneten Enden für die Ligation in den gewünschten Vektor.

Enden für die Ligation in einen mit Restriktionsenzymen geschnittenen Vektor oder Sequenzüberlappungen für das Gibson Assembly sein. Schematische Darstellung der Transformation einer rekombinanten DNA in eine Bakterienzelle und anschließender Antibiotika-Selektion. Tian: Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways. Band 4, Nummer 7, 2009, S. W: A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.

Kurosawa: Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products. Feng: A universal cloning vector using vaccinia topoisomerase I. Shuman: DNA strand transfer catalyzed by vaccinia topoisomerase: ligation of DNAs containing a 3′ mononucleotide overhang. Shuman: Covalent and noncovalent DNA binding by mutants of vaccinia DNA topoisomerase I.

Bookmark the permalink.